"Yapısal biyoloji dünyasında, bilim adamları proteinlerin kesin yapısını öğrenmek ve işlevlerini çıkarmak için X-ışını kristalografisi ve kriyo-elektron mikroskopisi gibi teknikleri kullanıyorlar, ancak bir hücrede nerede işlev gördüklerini öğrenmiyoruz" dedi. ve NSLS-II bilim adamı Lisa Miller. "Belirli bir hastalığı inceliyorsanız, bir proteinin yanlış yerde çalışıp çalışmadığını bilmeniz gerekir ."
Miller ve meslektaşları tarafından geliştirilen yeni teknik, biyolojide geleneksel floresan mikroskopi yöntemlerine benzer, burada yeşil floresan proteini (GFP) adı verilen bir molekül , yerlerini ortaya çıkarmak için diğer proteinlere eklenebilir. GFP UV'ye veya görünür ışığa maruz kaldığında , parlak yeşil bir renk verir, böylece hücrede "görünmez" bir proteini aydınlatır.
"GFP kullanarak, bir proteinin çekirdek veya sitoplazma gibi yüzlerce nanometre büyüklüğünde hücre altı yapılarda olup olmadığını görebiliriz," dedi Miller, ancak hücre zarına benzeyen, sadece yedi ila 10 nanometre büyüklüğünde yapılar , GFP gibi görünür ışık etiketleriyle görmek zordur. Bir hücredeki 10 nanometre büyüklüğündeki yapıları görmek için röntgen kullanımından çok faydalanırsınız. "
Bu zorluğun üstesinden gelmek için NSLS-II'deki araştırmacılar, Massachusetts Teknoloji Enstitüsü (MIT) ve Boston Üniversitesi'nde (BU) bilim adamları ile bir araya gelerek lantanide bağlayıcı etiket (LBT) adı verilen X ışına duyarlı bir etiket geliştirdiler. LBT'ler erbium ve öropyum gibi lantanid serisindeki elementlere sıkıca bağlanabilen çok küçük proteinlerdir.
NSLS-II'de araştırma görevlisi olan baş yazar Tiffany Victor, "UV'ye veya görünür ışığa maruz kaldığında floresan GFP'nin aksine, lantanidler X-ışınları varlığında floresan" dedi. "Ve lantanidler hücrede doğal olarak oluşmadığından, onları X-ışını mikroskobu ile gördüğümüzde, ilgilenilen proteinimizin yerini biliyoruz."
NSLS-II, MIT ve BU'daki araştırmacılar, LBT teknolojisini X-ışını-floresan ile birleştirmek için birlikte çalıştılar.
Miller, "LBT'ler son on yılda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, hiçbir zaman X-ışını floresans çalışmaları için kullanılmamışlardır." Dedi.
Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmenin ötesinde, X-ışını floresanı aynı anda bir hücredeki kalsiyum, potasyum, demir, bakır ve çinko gibi tüm eser elementler üzerinde kimyasal görüntüler sağlar. Diğer çalışmalarda Miller'in ekibi, bakır gibi eser elementlerin Alzheimer gibi hastalıklarda nöron ölümüyle nasıl bağlantılı olduğunu araştırıyor. Bu elementlerin yerini belirli proteinlerle ilişkili olarak görselleştirmek yeni bulguların anahtarı olacaktır.
X-ışınlarıyla uyumluluklarına ek olarak, LBT'ler, görünür ışık etiketlerine kıyasla nispeten küçük boyutları için de faydalıdır.
"Sana bağlı, tüm vücudunun büyüklüğünde ya da daha büyük bir kuyruğun olduğunu hayal et," dedi Miller. "Artık yapamayacağınız pek çok normal aktivite olurdu. Ama eğer sadece küçük bir domuz kuyruğuyla dolaşmak zorunda kalırsanız, yine de koşabilir, zıplayabilir ve kapılardan geçebilirsiniz. büyük kuyruk — birçok proteinin işlevi için gerçek bir engel olabilir. Ancak bu küçük lantanid bağlayıcı etiketler neredeyse görünmez. "
Proteinleri nano ölçekli çözünürlükle 3-D'de görüntülemek için LBT'lerin kullanımını göstermek için, MIT ve BU'daki araştırmacılar bir bakteri hücresindeki iki proteini (bir sitoplazmik protein ve bir membran proteini) etiketlediler. Daha sonra Miller'ın ekibi NSLS-II'deki Sert X-ışını Nanoprobe (HXN) ışın hattında ve DOE'nin Argonne Ulusal Laboratuvarı'nda bir DOE Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi'nde bulunan Foton Kaynağı (APS) 'da Bionanoprobe ışın hattında örnek çalıştı.
HXN lider ışın çizgisi bilim adamı Yong Chu, "HXN, yaklaşık 12 nanometreye kadar inen, dünyanın önde gelen X-ışını odak boyutunu sunuyor. Bu, bakteri hücresini nano ölçekli çözünürlükte 3 boyutlu olarak görüntülemek için kritik öneme sahipti." Dedi. "Ayrıca , ölçümlerin verimliliğini optimize etmek için hücreleri özel bir numune tutucuya monte etmek için yeni bir yol geliştirdik ."
HXN'in benzersiz çözünürlüğünü LBT'lerin yetenekleriyle birleştirerek, ekip etiketli proteinlerin her ikisini de görüntüleyebildi. Hücre zarı proteininin görselleştirilmesi LBT'lerin yüksek çözünürlükte görülebildiğini gösterirken, sitoplazmik proteinin görüntülenmesi LBT'lerin hücre içinde de görüntülenebileceğini gösterdi.
"Yüksek konsantrasyonlarda, lantanidler hücreler için toksiktir," dedi Victor, "bu nedenle, hücreleri, hücre zarı ve görüntüsünü geçecek kadar toksik olmayan ve yeterince önemli olan çok düşük bir lantanid konsantrasyonu ile tedavi edebildiğimizi göstermek bizim için önemliydi. görmek istediğimiz proteinleri. "
Şimdi, bu yeni teknik başarıyla gösterildi, bilim adamları 10 nanometre çözünürlükte hücre içindeki diğer proteinleri görüntülemek için LBTs kullanmayı umuyoruz.
Kaynak: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b11571#
